Использование антисмысловых ДНК и РНК олигонуклеотидов.

I. Реверсия ракового фенотипа.

Подмена мутантной аллели гена на нормальную копию.

В первый раз попытка генной терапии в поликлинике была предпринята М.Клайном в 1983 году., когда им было осуществлено введения обычного бета-глобинового гена нездоровым бета-талассемией. Позже была разработана методика генной терапии наследной дефицитности аденозин-деаминазы (тяжкий иммунодефицит): обычный ген Использование антисмысловых ДНК и РНК олигонуклеотидов. был введен в клеточки костного мозга хворого и после их ретрансплантации восстановилась активность фермента, состояние хворого стало лучше. Проведены клинические опыты по генотерапии рака. В лейкоциты нездоровых злокачественной меланомой и поздними стадиями рака были введены гены, маркирующие злокачественные клеточки (чтоб их могла узнавать имунная система). У половины нездоровых размеры опухолей Использование антисмысловых ДНК и РНК олигонуклеотидов. уменьшились вдвое и поболее.

- клеточки остеосаркомы имели мутации в гене Rb1; введение кДНК обычного гена Rb1 в эти клеточки в культуре вызывало их реверсию;

- в раковые клеточки также в культуре вводился обычный ген wt53; под его действием раковые клеточки теряли характеристики ракового фенотипа. Из работы не ясно, как Использование антисмысловых ДНК и РНК олигонуклеотидов. размеренна реверсия раковых клеток в этих опытах.

Перенос в раковые клеточки обычной аллели гена в случае мутации с потерей функции.

Угнетение экспрессии мутантной аллели гена в случае доминантно-негативной мутации.

Внедрение антисмысловых ДНК и РНК олигонуклеотидов.

Антисмысловая РНК— получаемый искусственно либо природный полирибонуклеотид, комплементарный определенной мРНК и подавляющий Использование антисмысловых ДНК и РНК олигонуклеотидов. ее биологическую активность за счет образования с ней дуплекса, что препятствует трансляции мРНК на рибосомах. Природные А.РНК являются главными компонентами одной из систем негативной регуляции экспрессии генов как у микробов, так и у эукариот. Для искусственного получения А.РНК в экспрессионный вектор вставляют нуклеотидную последовательность ДНК из мотивированного гена Использование антисмысловых ДНК и РНК олигонуклеотидов. в оборотной ориентации по отношению к промотору, чтоб транскрибировалась незначащая цепь гена с образованием А.РНК; потом на таковой рекомбинантной плазмиде производят синтез А.РНК (обычно в бактериальных клеточках). Искусственная А.РНК употребляется в экспериментальной работе, также как средство для исцеления разных патологий. Использовать А.РНК для угнетения экспрессии генов в Использование антисмысловых ДНК и РНК олигонуклеотидов. первый раз было предложено Дж. Изантом и Г. Вайнтраубом в 1984 г

3.2) Внедрение рибозимов (M1 субъединица РНКазы P, hammerhead-рибозимы).

Одними из главных различий, обнаруживаемых меж нормальными и раковыми клеточками, являются генетические различия ряда генов, контролирующих пролиферацию. В геноме опухолевых клеток нередко обнаруживают мутации в генах 2-ух типов: онкогенах Использование антисмысловых ДНК и РНК олигонуклеотидов. и генах-супрессорах опухолевого роста, либо антионкогенах.

Онкогены эволюционно консервативны и вызывают неопластическую трансформацию клеток как при ретровирусной инфекции в природных критериях (так как они нередко бывают включены в состав генома ретровирусов), так и после введения ДНК онкогенов в культивируемые клеточки при помощи трансфекции. Большая часть онкогенов сначала Использование антисмысловых ДНК и РНК олигонуклеотидов. было найдено конкретно в составе генома онкогенных вирусов, и они являются мутантными производными протоонкогенов, присутствующих в здоровых клеточках многоклеточных организмов и активирующихся во время эмбриогенеза, роста клеток либо регенерации тканей. Так как активированные онкогены в опухолевых клеточках, обычно, сверхэкспрессируются и кодируемая ими РНК по собственной первичной структуре отличается от Использование антисмысловых ДНК и РНК олигонуклеотидов. РНК протоонкогенов, РНК онкогенов являются неплохой возможной мишенью для рибозимов. Мутация в кодоне 12 гена H-ras , приводящая к подмене GGC на GUC, делает консенсусный веб-сайт, по которому HH-рибозим может расщеплять мутантную мРНК. In vitro было продемонстрировано пятикратное различие в эффективности деяния рибозима на мутантную H-ras-РНК и подобающую Использование антисмысловых ДНК и РНК олигонуклеотидов. РНК одичавшего типа. Получены H-ras-зависимые полосы клеток, размеренно трансформированные экспрессирующим вектором, который направлял синтез HH-рибозима под контролем промотора бета-актинового гена . Для таких клеток свойственна пониженная скорость пролиферации, сопряженная с уменьшением внутриклеточных уровней H-ras-РНК и белка р21 , кодируемого этим геном. Дальше рибозим экспрессировали в Использование антисмысловых ДНК и РНК олигонуклеотидов. клеточках полосы EJ карциномы мочевого пузыря человека . Введение начальных клеток мышам сопровождалось их резвой смертью на фоне развития высокоинвазивных опухолей. В отличие от этого копии EJ-клеток, экспрессирующих рибозим, в организме мышей обладали резко сниженным опухолевым фенотипом. Образующиеся опухоли были малоинвазивны, и наблюдалось примерно двукратное увеличение уровня Использование антисмысловых ДНК и РНК олигонуклеотидов. выживаемости мышей с трансплантатами. Гистологические исследования подтверждали слабенькую способность опухолей к метастазированию. Рибозимы в опухолях обнаруживались способом ПЦР в протяжении 86-90 дней. елковый продукт гена c-fos участвует в передаче сигнала эукариотическими клеточками, вовлечен в синтез ДНК и может придавать клеточкам устойчивость к противоопухолевым продуктам. Последние два характеристики этого белка находят доказательство в Использование антисмысловых ДНК и РНК олигонуклеотидов. том, что при проведении исцеления нередко применяемым противоопухолевым лекарством цисплатином (цис-диаминодихлорплатина) происходит индукция гена c-fos прямо за генами dTMP-синтазы и ДНК- полимеразы .

Рибозим, разрушающий c-fos-мРНК, снижал конечный уровень экспрессии гена c-fos, приводил к увеличению чувствительности опухолевых клеток к химиотерапевтическим агентам (включая Использование антисмысловых ДНК и РНК олигонуклеотидов. цис- платину) и существенно подавлял экспрессию генов dTMP-синтазы, ДНК-полимеразы бета и гена металлотионеина человека hMTII-A .

Аберрантная филадельфийская хромосома появляется в итоге транслокации (9;22)(q34;q11) в стволовых клеточках костного мозга, что сопровождается слиянием генов bcr и abl с образованием химерного онкогена bcr/abl и развитием приобретенных Использование антисмысловых ДНК и РНК олигонуклеотидов. миелоидных лейкозов (ХМЛ) . Транскрипт химерного гена кодирует белок р210bcr/abl , который обладает завышенной активностью тирозинкиназы. Такие РНК и белок обнаруживаются практически у всех нездоровых с синдромом ХМЛ, также у 50% пациентов с острым лимфобластоидным лейкозом , у каких имеется филадельфийская хромосома.

При помощи рибозимов, специфично расщепляющих последовательность химерной мРНК в месте Использование антисмысловых ДНК и РНК олигонуклеотидов. стыковки последовательностей 2-ух генов, удалось подавить экспрессию химерного гена bcr/abl в культивируемых клеточках.

Экспрессия рибозимов в культивируемых клеточках вызывала понижение уровня bcr/abl-мРНК, стопроцентно перекрыла образование химерного белка р210bcr/abl и ингибировала рост клеток на 84%. Эти результаты были существенно лучше эффектов, вызываемых антисмысловыми олигонуклеотидами.

В других Использование антисмысловых ДНК и РНК олигонуклеотидов. работах был получен рибозим, расщепляющий химерную РНК по кодону GUU, расположенному по соседству с местом стыковки последовательностей 2-ух генов. Этот рибозим разрушал подобающую РНК in vitro и in vivo, также подавлял тирозинкиназную активность белка р210.


ispolzovanie-ikt-dlya-realizacii-adaptivnogo-obucheniya-na-urokah-informatiki.html
ispolzovanie-ikt-pri-obuchenii-gluhih-i-slaboslishashih-uchashihsya-na-integrirovannih-urokah-fiziki-i-russkogo-yazika-v-starshih-klassah.html
ispolzovanie-illyustrativnogo-materiala-koncepciya-professionalno-tvorcheskoj-podgotovki-pedagoga-nachalnogo-obrazovaniya.html